Chimie

Cours pratique 5 : PCR inverse - délétion de segments de gènes

Cours pratique 5 : PCR inverse - délétion de segments de gènes


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Les amorces

Les amorces sont pour la plupart de courts oligonucléotides d'ADN ou d'ARN qui servent de point de départ à la synthèse d'ADN par les ADN polymérases.

Les amorces adaptées à une utilisation en PCR doivent être

  • avoir une longueur de 18 à 24 nucléotides,
  • pas de boucles internes en épingle à cheveux (boucles en épingle à cheveux) ou d'autres structures secondaires,
  • ne se lient pas à eux-mêmes (homodimères) ou à d'autres amorces (hétérodimères),
  • ont une distribution uniforme de purines et de pyrimidines et n'ont pas de zones dans lesquelles de nombreux nucléotides identiques se succèdent, et
  • approximativement les mêmes températures de fusion (T.m) dans la plage de 55 à 65 ° C.

Conseils pour choisir un apprêt

Les amorces sont choisies de manière à se lier aux séquences complémentaires de la matrice d'ADN et à fournir à la polymérase un 3'-OH libre pour démarrer la polymérisation.Il est extrêmement important que les trois ou quatre derniers nucléotides correspondent exactement et soient stables. En raison de la plus grande stabilité, l'amorce doit avoir deux ou mieux trois extrémités de paires de bases GC1). Si le dernier nucléotide ne correspond pas, la PCR ne réussira pas.

La température de fusion (T.m) peut être calculé pour chaque amorce à l'aide d'une formule simple (voir température d'hybridation). Si la température de fusion des deux amorces est trop différente, au moins une des deux amorces ne se liera pas de manière optimale à l'ADN.

La concentration d'amorce est également un facteur important : si l'amorce est utilisée à une concentration trop faible, il y a peu ou pas de produit de réaction, tandis qu'une concentration d'amorce trop élevée peut entraîner une liaison non spécifique de l'amorce (amorçage incorrect) et une accumulation de produits non spécifiques . En pratique, des concentrations d'amorces comprises entre 0,1 et 1,0 µmol/L se sont avérées particulièrement adaptées. Les amorces sont produites de manière synthétique (voir aussi la synthèse des oligonucléotides) et peuvent également être marquées selon la méthode de détection souhaitée (voir la section Les nucléotides ci-dessous).


Vidéo: Inverse PCR (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Adriano

    C'est dommage que maintenant je ne peux pas exprimer - je suis en retard pour une réunion. Mais je serai libéré - j'écrirai nécessairement que je pense sur cette question.

  2. Galinthias

    Variante idéale

  3. Kivi

    Il y a quelque chose aussi, je pense que c'est une bonne idée.

  4. Vishakar

    Quels mots ... super, une magnifique phrase



Écrire un message